Studietaak 3: Post-translationele modificaties

Veel eiwitten bestaan niet alleen uit aminozuren; allerlei extra groepen kunnen eraan zijn gezet, zoals suikergroepen, fosfaatgroepen etc. Aangezien deze groepen er na de translatie worden aangezet, noemen we deze extra groepen post-translationele modificaties. Ook het proces van het aanzetten van deze extra groepen wordt post-translationele modificatie genoemd.

Overigens vormt de meest voorkomende post-translationele modificatie, namelijk glycosylering, al meteen een uitzondering op de naam post-translationele modificatie, aangezien het aankoppelen van suikergroepen vaak tijdens de translatie (dus in feite co-translationeel) wordt uitgevoerd. Toch wordt glycosylering meestal tot de post-translationele modificaties gerekend.

Een tweede belangrijke groep van modificaties is het afsplitsen van delen van het eiwit d.m.v. specifieke proteolytische enzymen. Deze groep van post-translationele modificatie speelt een rol bij twee belangrijke processen: eiwitsortering en de activering van precursor-vormen van eiwitten (met name bij peptide-hormonen en proteolytische enzymen).

Voor een overzicht van dit soort post-translationele modificaties zie http://en.wikipedia.org/wiki/Posttranslational_modification of http://web.indstate.edu/thcme/mwking/protein-modifications.html  

Aangezien jullie leerboeken weinig informatie bevatten over met name glycosylering heb ik besloten de leerstof dan maar grotendeels zelf te schrijven en deze volgt dus hieronder.

1 GLYCOSYLERING

De meest voorkomende extra groepen (althans bij eukaryoten) zijn de oligosachariden; eiwitten met een of meer oligosaccharide-groepen noemen we glycoprote´nen. De aangekoppelde oligosachariden worden meestal glycanen genoemd. De meeste extracellulaire eiwitten en membraaneiwitten van hogere eukaryoten (dus ook die van ons) zijn geglycosyleerd. Het proces waarin deze suikers aan eiwitten worden gezet, noemen we glycosylering. Er bestaan twee vormen van glycosylering: N-glycosylering en O-glycosylering, waarvan N-glycosylering het belangrijkst is (het vaakst voorkomt). N-glycosylering is genoemd naar het N-atoom van asparagine waar de suikergroep aan wordt gezet (zie Figuur 1). Hoe de 'suikerbomen' eruit zien die aan glycoprote´nen zitten, verschilt per groep van eukaryoten (zie Figuur 2).

Figuur 1: N-glycosylering (= koppeling van een oligosaccharide aan een asparagine) en O-glycosylering (= koppeling van een oligosaccharide aan een serine of threonine)

Figuur 2: Voorbeelden van N-glycosylering bij verschillende organismen

Animatie glycoslering integraal membraaneiwit

Wat blijkt als we de aminozuurvolgorde van eiwitten bekijken waarvan we weten dat ze N-geglycosyleerd zijn? Bij alle asparagines waaraan een oligosaccharide is gekoppeld, wordt twee aminozuren verderop een serine of een threonine - dus een hydroxyl-groep bevattend aminozuur - gevonden. Tussen die R en S/T kan zich elk willekeurig aminozuur bevinden, behalve proline. De 'consensus' voor een N-glycosyleringssite is dus Asn-X-Ser/Thr (met X = elk aminozuur behalve Pro) oftewel N-X-S/T. Vrijwel alle N-glycsosyleringssites voldoen aan deze consensus; soms wordt het tripeptide Asn-X-Cys aangetroffen (in plaats van Asn-X-Ser/Thr). 

Overigens betekent dit niet dat elke keer dat we een N-X-S/T sequentie in een (extracellulair) eiwit vinden dit eiwit op die plaats ook daadwerkelijk geglycosyleerd is. De vouwing van het eiwit speelt namelijk een belangrijke rol bij de regulatie van de glycosylering. Er wordt nog veel onderzoek gedaan naar hoe de rest van het eiwit bepaalt aan welke consensus-site daadwerkelijk een suikergroep wordt geplaatst en aan welke niet.

De functie van glycanen:

Glycanen kunnen allerlei functies hebben. De  De belangrijkste algemene rollen zijn:

Het belang van kennis over glycosylering:

Hier enkele voorbeelden van het belang van (kennis van) glycosylering in jullie vakgebied:

Figuur 3: Vereenvoudigde (!) weergave van de N-glycosylering. Elke roze pijl staat voor een reactie in de route waarvan een enzymdefect bekend is. De afkortingen bij die pijlen staan voor de aandoeningen die door het betreffende defect worden veroorzaakt. Uit deze figuur blijkt dat N-glycosylering plaatsvindt tijdens het transport van het betreffende eiwit door ER en Golgi.

 

Figuur 4: Voorbeeld van de detectie van het al dan niet geglycosyleerd zijn van transferrine m.b.v. IEF. Bij IEF worden eiwitten gescheiden op basis van hun Iso-Elektrisch Punt (IEP). Het IEP van het geglycosyleerde transferrine is anders dan dat van onvolledig of niet geglycosyleerd transferrine. Omdat ik deze figuur van internet geplukt heb, weet ik niet wat hier precies te zien is. Ik denk dat op het onderste plaatje 0 betekent dat er geen glycan is aangebracht, 1 dat er 1 van de 2 glycanen is aangebracht en dat 2 staat voor correct geglycosyleerd transferrine (met twee glycanen). Wat in beide panelen te zien is, is dat bij de meeste hier getoonde aandoeningen een deel van het transferrine correct geglycosyleerd is. Alleen bij CDGS type II wordt er geen correct geglycosyleerd transferrine gevonden. 
Als je zelf wilt opzoeken op welke aminozuurposities humaan transferrine N-geglycosyleerd is, dan vind je dat hier. Transferrine in 3D vind je hier.
 

2 PROTEOLYTISCHE KLIEVING

Een andere vorm van post-translationele modificaties is het afklieven (door specifieke peptidases) van bepaalde stukken van een eiwit, nadat het uit het ribosoom is komen rollen. Dit kan verschillende functies hebben:

  1. Het afklieven van zogenaamde signaalsequenties tijdens het transport van eiwitten naar buiten de cel (bij pro- en eukaryote cellen) of naar cel-organellen (bij eukaryote cellen); dit noemen we eiwit-adressering of eiwit-sortering: de verschillende soorten signaalsequenties Ĺvertellenĺ de cel waar eiwitten naartoe moeten (net als postcodes in de sorteercentrale van het postkantoor). Overigens worden de signaalsequenties er bij eiwit-adressering niet altijd afgehaald, dus eigenlijk gaat het bij eiwit-adressering niet altijd over post-translationele modificaties.
  2.  De activatie van enzymen (bij pro- en eukaryoten) en van peptide-hormonen (bij hogere eukaryoten). Bekende voorbeelden hiervan zijn respectievelijk de proteolytische enzymen in onze spijsvertering (die bij aankomst in het darmlumen worden geactiveerd door afsplitsing van een pro-sequentie) en insuline (dat bij aankomst in de bloedstroom wordt geactiveerd door specifieke verwijdering van het CŚpeptide). 

2.1 Eiwitsortering/-adressering (mogelijk zitten hier niet werkende links bij):

Bij prokaryoten zijn signaalpeptides aan de N-terminus te vinden van eiwitten die naar buiten de cel moeten of naar de membraan of celwand van de bacterie. Deze worden er tijdens het transport afgehaald door een specifiek protease (de zogenaamde singaalpeptidases).

Vergelijkbare N-terminale signaalpeptides zijn te vinden bij eukaryote eiwitten die de zogenaamde secretoire route ingaan (= secretie naar buiten de cel of naar celmembraan via ER en Golgi; zie Campbell p. 325 en 326) en bij eukaryote eiwitten die naar de mitochondriŰn moeten. Ook deze peptides worden tijdens het transport verwijderd door een specifiek protease.

Bij eukaryoten hebben we dan nog signaalsequenties (= stukjes aminozuurvolgorde) die niet worden afgesplitst en die dus formeel niet onder de post-translationele modificaties vallen. Deze signaalsequenties bevinden zich meestal ergens midden in het eiwit of bij de C-terminus in de buurt. Dit zijn de signaalsequenties die ervoor zorgen dat:

Kennis over de precieze locatie van pre-sequenties en pro-sequenties (zie hieronder in 2.2) in eiwitten is heel belangrijk. Een voorbeeld uit de biotechnologie: als ik humaan groeihormoon wil laten produceren door een bacterie (om dit als therapeutisch eiwit te gebruiken voor kinderen met een groeistoornis) dan moet ik die bacterie het mature eiwit laten maken en niet de precursor-vorm, zoals die in de humane pijnappelklier wordt gemaakt. De bacterie herkent de signaalsequentie namelijk niet en splitst deze ook niet af. Ik maak dus niet het mature eiwit, zoals ik dat aan de patiŰnt zou willen toedienen. Wat ik wel kan doen, is de bacterie zodanig genetisch modificeren dat deze humaan groeihormoon maakt voorafgegaan door een bacteriŰle signaalsequentie die ervoor zorgt dat het eiwit naar buiten de cel wordt gesecreteerd en die tijdens dit transport wordt afgesplitst door de bacterie. 

Verhelderende en verdiepende links:
Animatie secretie bij eukaryoten

Animatie targeting bij eukaryoten
Secretie bij prokaryoten 1  
Secretie bij prokaryoten 3  
Eiwit-adressering bij eukaryoten  
Eiwitsecretie bij eukaryoten

Ik zou hier nog van alles kunnen vertellen over wat we weten over de verschillende soorten signaalsequenties bij prokaryoten en voor de diverse organellen van eukaryoten en over hoe de cel deze herkent. Door tijdgebrek gaat dit nu niet lukken, dus ik bewaar dit onderwerp maar voor later. Diegenen van jullie die in het bezit zijn van het boekje 'Atlas van de biochemie' cq 'Atlas der Biochemie' kunnen meer vinden over eukaryote signaalsequenties in het onderdeel 'Eiwitadressering' (pagina 228 en 229 in de NL versie).

Leerstof: Het bovenstaande en Campbell pagina's 325 en 326! Op de site/CD van Campbell vind je ook oefenvragen over dot onderwerp.

Oefenvraag:

Eukaryote cellen kunnen eiwitten die gesecreteerd moeten worden of eiwitten die naar de organellen behorend tot het endomembraan-systeem moeten worden getransporteerd onderscheiden van eiwitten die in het cytoplasma moeten blijven doordat...

  1. er twee typen ribosomen zijn: een type dat cytoplasmatische eiwitten synthetiseert en een type dat gesecreteerde of organel-specifieke eiwitten synthetiseert
  2. sommige eiwitten - tijdens hun synthese - een signaalgebied bevatten dat ervoor zorgt dat het ribosoom met het groeiende polypeptide zich aan het ER hecht en het polypeptide het lumen van het ER in wordt gebracht tijdens de synthese
  3. eiwitten die gesecreteerd moeten worden of naar een bepaald compartiment moeten worden getransporteerd allemaal in de celkern worden gesynthetiseerd, terwijl cytoplasmatische eiwitten in het cytoplasma worden gesynthetiseerd
  4. elk compartiment in de cel zijn eigen ribosomen heeft die de eiwitten voor dat compartiment synthetiseren

2.2 Proteolytische activatie

Veel eiwitten worden gesynthetiseerd als inactieve precursors (of voorlopers of pro-eiwitten) die worden geactiveerd door specifieke proteolyse = het afsplitsen van een deel van het eiwit. Hierbij ontstaat de actieve of mature vorm van het eiwit. De spijsverteringsenzymen die worden geproduceerd door de pancreas en de eiwitten betrokken bij de bloedstollingscascade zijn hier voorbeelden van. Maar ook bacteriŰn maken een deel van hun eiwitten als inactieve precursors (zie bijvoorbeeld dit eiwit van een melkzuurbacterie, waarmee het de melk-eiwitten buiten de cel afbreekt). Precursor/voorloper-eiwitten van enzymen worden vaak zymogenen genoemd.

Specifieke proteolytische klieving voor de activering van precursor-eiwitten wordt uitgevoerd door specifieke enzymen die peptidases of proteases worden genoemd. Deze specifieke groep van proteases/peptidases knippen eiwitten niet zomaar kapot, maar op heel specifieke plaatsen, die ze herkennen doordat op die plaatsen bepaalde aminozuurvolgordes aanwezig zijn; hierover straks meer. Om een indruk krijgen van het aantal tot dusver ontdekte peptidases zou je eens kunnen kijken in de Peptidase Database

Aangezien vrijwel alle pro-eiwitten hun werk buiten de cel doen, zijn dus de meeste pro-eiwitten ook prepro-eiwitten, omdat ze naast het pro-gedeelte (dat afgesplitst wordt als ze geactiveerd worden) ook een pre-gedeelte bevatten (dat afgesplitst wordt tijdens het transport naar buiten de cel): prepro-eiwit in de cel > pro-eiwit buiten de cel > matuur eiwit buiten de cel (op de plek en het moment dat het zijn werk moet doen). In het voorbeeld van hierboven zie je dat de pre-sequentie (ook wel pre-peptide, signaalpeptide, signaalsequentie of leader genoemd) bestaat uit aminozuur 1-33 en de pro-sequentie uit aminozuur 34-187. Het mature eiwit bestaat uit aminozuur 188-1870.

De belangrijkste groepen proteolytisch geactiveerde eiwitten bij de mens:

1. The digestive enzymes that hydrolyze proteins are synthesized as zymogens in the stomach and pancreas (Table 10.3).

2. Blood clotting is mediated by a cascade of proteolytic activations that ensures a rapid and amplified response to trauma.

3. Some protein hormones are synthesized as inactive precursors. For example, insulin is derived from proinsulin by proteolytic removal of a peptide (het C-peptide).

4. The fibrous protein collagen, the major constituent of skin and bone, is derived from procollagen, a soluble precursor.

5. Many developmental processes are controlled by the activation of zymogens. For example, in the metamorphosis of a tadpole into a frog, large amounts of collagen are resorbed from the tail in the course of a few days. Likewise, much collagen is broken down in a mammalian uterus after delivery. The conversion of procollagenase into collagenase, the active protease, is precisely timed in these remodeling processes.

6. Programmed cell death, or apoptosis, is mediated by proteolytic enzymes called caspases, which are synthesized in precursor form as procaspases. When activated by various signals, caspases function to cause cell death in most organisms, ranging from C. elegans to human beings. Apoptosis provides a means sculpting the shapes of body parts in the course of development and a means of eliminating cells producing anti-self antibodies or infected with pathogens as well as cells containing large amounts of damaged DNA.

Logisch puzzelen met behulp van peptidases:

De aminozuurvolgordes van eiwitten worden al jaren bepaald door de DNA-sequentie van het bijbehorende gen te bepalen (= sequencing) en hier de aminozuurvolgorde van het eiwit uit af te leiden. Voor de komst van de DNA-sequencing werden aminozuurvolgordes bepaald aan de eiwitten zelf. Hiertoe werden ze eerst in stukjes gehakt met op specifieke plaatsen knippende proteolytische enzymen. Van die stukjes werden dan de aminozuurvolgordes bepaald en weer aan elkaar gepuzzeld tot de aminozuurvolgorde van het complete eiwit.

Ondanks het feit dat deze strategie overbodig is geworden, is het toch goed voor jullie om hier weet van te hebben. Het maken van brokstukken van eiwitten m.b.v. proteolytische enzymen is namelijk weer helemaal hot, maar dan als hulpmiddel in de proteomics-technologie, namelijk bij peptide mass fingerprinting.

De beste manier om een idee van dit onderwerp te krijgen, is via onderstaande opgaven. Als je ze zelf hebt geprobeerd, kun je onder aan de pagina de juiste antwoorden opzoeken. In de toets zal ik enkele vergelijkbare opgaven opnemen. In feite gaat het hier om logisch puzzelen met eiwitten.....

Om de opgaven te kunnen maken, moet je wel weten welke aminozuurvolgordes door de meestal in het lab gebruikte proteolytische enzymen worden herkend en hoe ze deze knippen. Dit vind je voor  Verder is er ook nog een niet-enzym dat bij deze strategie wordt gebruikt: cyanogeenbromide (CNBr). Ook wat deze stof met eiwitten doet, is in onderstaande tabel aangegeven. Deze tabel krijg je er in de toets bij!

Tabel 1: Specifieke klieving van eiwitten


Reagens Cleavage site (klievingsplaats); zie ook figuur hieronder!

Chemische klieving:
Cyanogeenbromide C-terminale kant van Met:
P1 = Met (M)
Enzymatische klieving:
Thermolysine (uit de bacterie Bacillus thermoproteolyticus) Knipt in eiwitten aan de N-terminale kant van Leu of Val of Ile of Met (= de vertakte alifatische aminozuren)
Dit lukt niet als zich aan de andere kant van de te splitsen peptidebinding een Pro bevindt:
P1' = Leu (L), Val (V), Ile (I) of Met (M)
mits P1 geen Pro (P)
Trypsine (uit de spijsvertering) Knipt in eiwitten aan de C-terminale kant van Arg of Lys (= de sterk basische aminozuren)
Dit lukt niet als zich aan de andere kant an de te splitsen peptidebinding een Pro bevindt:
P1 = Arg (R), Lys (K)
mits P1' geen Pro (P)
Chymotrypsine (uit de spijsvertering) Knipt in eiwitten aan de C-terminale kant van Tyr of Trp of Phe (= de aromatische aminozuren)
Dit lukt niet als zich aan de andere kant an de te splitsen peptidebinding een Pro bevindt:
P1 = Tyr (Y), Trp (W), Phe (F)
mits P1' geen Pro (P)
Carboxypeptidase A (uit de spijsvertering) Knipt het C-terminale aminozuur van een eiwit af, maar doet dit niet als het een na laatste aminozuur een Pro is:
P1' = C-terminale aminozuur
mits P1 geen Pro (P)

 

Eerst maar eens een voorbeeld. Gegeven:

Wat is de aminozuurvolgorde van dit nonapeptide?

Antwoord:TYVKAAWGK

Opgaven:

1. Het hormoon alfa-melanotropine heeft de volgende az-volgorde: SYSMEHFRWGKPV. Welke brokstukken onstaan bij behandeling van dit hormoon met
a. trypsine?
b. CNBr?
c. thermolysine?

2.
Een hormoon dat verwant is aan alfa-melanotropine is beta-melanotropine. Als beta-melanotropine geknipt wordt met trypsine ontstaan de volgende brokstukken:
WGSPPK
DSGPYK
MEHFR
D (= los aminozuur)
Uitgaande van maximale sequentie-homologie (= gelijkenis in az-volgorde) tussen beide hormonen, wat is dan de az-volgorde van beta-melanotropine?

3. Gegeven het volgende peptide: SEPIMAPVEYPK. Hoeveel brokstukken ontstaan er bij knippen van dit peptide met
a. CNBr?
b. trypsine?
c. chymotrypsine?
d. Doe een suggestie voor een zuivering van de peptiden, gevormd bij vraag a. Ga uit van werken bij neutrale pH.

4. Een logische eiwitpuzzel:
Een mutante vorm van het hormoon angiotensine II heeft de volgende aminozuursamenstelling (dus niet volgorde!):
(D, R, I, M, F, P, Y, V)
Het volgende wordt waargenomen:

  • Knippen met trypsine levert een dipeptide op waarin D en R worden gevonden en een hexapeptide met de rest van de aminozuren
  • Knippen met chymotrypsine levert twee tetrapeptides op met de volgende samenstelling (dus niet volgorde!): (D, R, Y, V) en (I, M, F, P)
  • Behandeling met CNBr levert een dipeptide op waarin F en P worden gevonden en een hexapeptide met de rest van de aminozuren
  • Het dipeptide uit de CNBr-behandeling kan niet gesplitst worden met chymotrypsine en ook niet met carboxypeptidase A

5. De aanwezigheid van disulfidebruggen in eiwitten kan worden getest mbv joodacetaat. Vrije cyste´nes reageren met deze verbinding, cyste´nes die deel uitmaken van een disulfide-brug doen dat niet. Het maken van eiwit-brokstukken m.b.v. proteolytische klieving in combinatie met joodacetaat-behandeling kan de onderzoeker vertellen tussen welke cyste´nes in een eiwit zich disulfidebruggen bevinden. In deze opgave een eenvoudig voorbeeld:
Apamine is een klein eiwit-toxine dat voorkomt in het gif van de honingbij. Het heeft de volgende az-sequentie: CNCKAPETALCARRCQQH
a. Apamine reageert NIET met joodacetaat. Hoeveel disulfide-bruggen heeft apamine?
b. Behandeling van apamine met trypsine levert twee peptiden op. Waar bevinden zich de disulfide-bruggen?

6. De volgende sequentie van een eiwit is bekend:
.......C.......F........C.......M......C....... (puntjes geven een onbekend aantal aminozuren aan).
Het is ook bekend dat twee van de drie cyste´nes met elkaar een disulfidebrug vormen. De aangegeven F is het enige aromatische aminozuur in dit eiwit. Ook de aangegeven methionine is het enige dat aanwezig is. Behandeling van dit eiwit met intact gelaten disulfide-brug m.b.v. CNBr of chymotrypsine levert GEEN splitsing in twee brokstukken op. Waar bevindt zich dan logischerwijs de disulfidebrug: 
tussen de 1e en de 2e C of 
tussen de 1e en de 3e C of
tussen de 2e en de 3e C? 

 


 

Antwoorden:
Tip:
denk wel altijd aan de blokkerende werking van Pro-residuen aan de andere kant van de knipplaats bij de proteolytische enzymen (CNBr heeft geen last van Pro's!)
1. a.
SYSMEHFR en WGKPV b. SYSM en EHFRWGKPV c. SYS en MEHFRWGKPV
2. DSGPYKMEHFRWGSPPKD
3. a. 2 b. geen (peptide blijft heel) c. geen (peptide blijft heel) d. antwoord in de les
4. DRVYIMPF
5. a.
2. b. Tussen de 1e en 2e C en tussen de 3e en 4e C
6. Tussen de 1e en de 3e C.