‘Virtueel kloneren’: afsluiting van het DNA-practicum bij Saxion

Begeleid door dr. ir. Peter Rauch, docent bij de opleiding Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek

 

Inleiding

Bij het practicum hebben jullie de laatste stap van de klonering van een stuk humaan DNA uitgevoerd: de isolatie van plasmide-DNA (pDNA) uit een getransformeerde Escherichia coli, gevolgd door een restrictie-analyse (= het knippen van het pDNA met een of meer restrictie-enzymen, gevolgd door agarose-gel-elektroforese).

Zoals jullie hebben geleerd, gaat aan deze laatste stap het een en ander vooraf: het in de plasmide-vector te inserteren DNA moet worden geknipt met een of meer restrictie-enzymen en worden geligeerd aan met dezelfde restrictie-enzymen geknipt vector-DNA. Deze stappen gaan jullie vandaag virtueel uitvoeren. Vandaag gaan jullie dus virtueel kloneren; bij het practicum hebben jullie het resultaat van de bijbehorende echte kloneringen geanalyseerd.

De constructen waar jullie bij het practicum mee hebben gewerkt (dus plasmide-vectoren met daarin een insert) zijn afkomstig van de vakgroep Humane Genetica van de Rijksuniversiteit Groningen. Elk construct bestaat uit een andere plasmide-vector met daarin ook steeds een ander stuk humaan DNA. Deze stukken humaan DNA hebben allemaal een code gekregen; deze verwijst o.a. naar het chromosoom waar het vandaan komt. De constructen hebben allemaal ook diezelfde code gekregen. In onderstaande tabel staat per construct gegeven wat de insert is en om welke vector het gaat.

Code construct (= gelijk aan code humane DNA-insert!)

Vector

D13S4

pBR322

D13S12

pBR329

D21S149

pUC18

Als er voldoende tijd is, gaan jullie naast de virtuele klonering ook de bovenstaande stukken humaan DNA identificeren door de sequenties ervan te vergelijken met bekende sequenties in de openbare databases m.b.v. het programma BLAST.

 

Virtueel kloneren met het programma CloneManager

Hierbij krijg je geen uitgebreide gedetailleerde handleiding. Ten eerste is die er niet en ten tweede heb ik in de praktijk gemerkt dat studenten (zowel bij de UT als bij Saxion) liever zelf de werking van een programma ontdekken dan via een handleiding.

A. Bekijk de hierboven genoemde vectoren

Ga in het programma CloneManager naar de map ‘VECTORS’ en open de files van de drie vectoren. Kijk of ze aan de voorwaarden van een goede plasmide-vector voldoen. Meer informatie over een vector vind je als je in het menu onder ‘View/Edit’ naar ‘Features’ gaat.

De volgende stappen voeren jullie voor elk van de drie bovengenoemde constructen uit, d.w.z.

B. Keuze van het te gebruiken restrictie-enzym

1. Haal de sequentie van de humane locus uit de map ‘DOC’ in het programma CloneManager.

2. Bekijk deze op de aanwezigheid van restrictiesites voor de veel gebruikte enzymen BamHI, HindIII, EcoRI en SacI. Dat kan voor allemaal tegelijk als volgt:
Menu: Enzyme > Find Sites > Multiple Enzymes > Option: All sites user list > List: 1st User List > klik op knop ‘All Find’. 

3. Noteer de antwoorden op de volgende vragen:

a. Welk restrictie-enzym levert een DNA-fragment op dat een zo groot mogelijk gedeelte van dit DNA-gebied omvat?

b. Hoe groot is dit fragment precies (in kb)?

4. Nu moet je natuurlijk ook nog checken of de vector waar je het fragment in moet ligeren (zie tabel in inleiding) een unieke restrictiesite bevat voor het gekozen restrictie-enzym. Is dit inderdaad het geval? Zo ja, ga verder. Zo nee, kies een ander enzym.

C. Virtueel knippen van humaan DNA en vector

1. Knip de humane locus met het bij B geselecteerde restrictie-enzym; het programma geeft dit fragment automatisch een naam en bewaart het in een lijst van moleculen. Dit wordt de insert van jullie klonering.

2. Doe hetzelfde met de vector.

D. Virtueel ligeren

1. Ligeer de DNA-fragmenten uit C aan elkaar. Bij een echte klonering kan de insert hierbij in twee oriëntaties in de vector terecht komen (waarom eigenlijk?). Dat betekent dat je eigenlijk bij deze klonering twee verschillende constructen maakt: eentje met het insert in de ene oriëntatie en eentje met het insert in de andere oriëntatie. Omdat we voor deze virtuele klonering niet heel veel tijd hebben, is het voldoende als jullie per construct maar één oriëntatie kiezen; het maakt hierbij niet uit welke oriëntatie je kiest. Geef dat construct de naam die erbij hoort (dus resp. D13S4, D13S12 of D21S149).

2. Bekijk het resultaat: hebben jullie inderdaad een construct gemaakt dat bestaat uit een E. coli-vector met daarin een stuk humaan DNA?

E. Identificatie van de constructen

Deze stap voer je uit als je voor alle drie de constructen de virtuele klonering hebt uitgevoerd.

Helaas kunnen we geen virtuele transformatie uitvoeren. We gaan er in deze stap dus vanuit dat we virtuele E. coli-kolonies hebben verkregen en dat we hier virtueel pDNA uit hebben geïsoleerd. De vraag is nu: met welk restrictie-enzym moeten we de constructen knippen als we ze willen identificeren?

Met andere woorden: stel je hebt drie epjes met daarin pDNA van de drie constructen. Met welk restrictie-enzym kunnen we deze pDNA’s dan knippen om op een agarose-gel te kunnen zien in welk epje zich welk construct bevindt? Zoek dit uit.

Voorwaarden:

Laat deze enzymen los op de drie constructen en bekijk bij welk enzym je voor de drie constructen een duidelijk verschillend resultaat krijgt. 

Noteer de groottes van de voorspelde DNA-fragmenten voor elke kloon.


Meer uit CloneManager halen

Als we tijd en zin hebben, kunnen we nog een of meer van de volgende opgaven (gemaakt door en voor Saxion-studenten) uitvoeren:

1A. Hoeveel sites bevat pBR327 voor het restrictie-enzym DdeI?
1B. Hoeveel sites bevat pGEM1 voor het restrictie-enzym AvaII?

2A. Op welke bp-posities beginnen de twee grootste ORFs in pBR329?
2B. Op welke bp-positie begint het ORF van het URA3-gen in Yrp17 en uit hoeveel aminozuren bestaat het bijbehorende eiwit?

3A. Uit hoeveel aminozuren bestaat het proteinase-eiwit dat hoort bij het gen op pNZ521?
3B. Uit hoeveel aminozuren bestaat het cat-eiwit dat hoort bij het gen op pBR329?

4A. Hoe groot zijn de fragmenten die ontstaan na digestie van pEX3 met ClaI?
4B. Hoe groot zijn de fragmenten die ontstaan na digestie van het kleinste fragment uit A met DdeI?

5A. Een van de onderstaande sequenties is die van de ribosoombindingsplaats van het kanamycine-resistentiegen van pACYC177. Welke?
a. ATTTAT  b. ATGAGC  c. TACAAG  d. TATAAT
5B. Hoe vaak komt deze sequentie voor in pACYC177?

6A. Wat is het laatste aminozuur van beta-lactamase gecodeerd door pUC19?
6B. Welke zes nucleotiden vind je direct voor het startcodon van dit gen?
6C. Uit hoeveel bp bestaat het kleinste SspI-GsuI-fragment in dit gen?

7A. Ligeer het 'divergente promotergebied' van de Prt-genen uit plasmide pNZ521 in pBR327. Noem de twee nieuwe constructen pLST1 en pLST2 en kopieer ze naar het klembord van Windows.
7B. Hoe kun je controleren of de klonering geslaagd is en hoe kun je bepalen of een kolonie pLST1 of pLST2 bevat?


Identificatie van de inserts

Als er tijd over is, gaan jullie de humane DNA-fragmenten die jullie virtueel hebben gekloneerd identificeren. Jullie doen dit m.b.v. het programma BLAST; dit is een soort Google voor DNA- en eiwitsequenties. Het programma vergelijkt een zoeksequentie met de bestaande DNA-sequenties in de openbare databases. Hits met een hoge score staan voor bekende sequenties de identiek zijn of sterk lijken op de zoeksequentie. Aangezien de sequentie van het hele humane genoom bekend is, moet dit voor de drie loci succesvol zijn.

Als we hier vandaag niet aan toekomen, kun je dit ook op een later moment zelfstandig doen.


Tip

Handige links m.b.t. gentechnologie vind je op http://lesmateriaal.saxion.nl/rzq/dna-technieken/start.htm (helaas zijn niet alle links meer up-to-date!)